乳腺癌前哨淋巴结活检已经成为临床腋窝淋巴结阴性乳腺浸润癌患者的标准腋窝处理术式，前哨淋巴结术中诊断可使前哨淋巴结阳性患者术中即可完成腋窝淋巴结清扫，并使前哨淋巴结阴性患者免于接受腋窝淋巴结清扫，因而使用精准、快速的诊断方法至关重要。
传统的术中冰冻切片技术和细胞印片技术速度快，但是由于其技术本身的局限性，无法对整个前哨淋巴结进行评估，难免存在漏诊的情况。vandeVrande等[1]研究显示，以淋巴结数为统计对象分析，冰冻切片技术和细胞印片技术的敏感度分别为69.7%和76.2%，但二者对微转移的敏感度仅为23.5%和35.4%；金标准病理石蜡切片诊断准确，可以发现宏转移、微转移和孤立肿瘤细胞，但经过标本固定、石蜡切片染色及诊断的流程耗费长，需要术后约2～5天才能出报告。使得部分患者需行二次手术进行腋窝淋巴结清扫，导致医疗费用增加，并给患者带来焦虑。
一步核酸扩增技术（OSNA）是一种仅需一步操作即可以淋巴结匀浆溶解液作为模板，采用核酸扩增技术检测标本的细胞角蛋白19（CK19）信使核糖核酸（mRNA）表达量，在术中提供区分宏转移、微转移和未发生转移的诊断，提示临床结果[2]。该技术应用于术中前哨淋巴结活检中具有精确度高、操作简便、快速性等特点，可以提高前哨淋巴结活检的检测灵敏度，降低患者二次手术风险。
图1、OSNA技术检测流程
图2、OSNA技术可定量检测CK19mRNA拷贝数
在针对例初始手术患者淋巴结的日本多中心研究[3]发现，OSNA技术与术后组织病理学检查具有同等的精确度，总一致性为92.9%，敏感度87.5%，特异度94.1%。
图3、OSNA技术与术后组织病理学检查具有同等精确度
随后，欧洲多家机构类似的临床研究[4,5]同样验证了OSNA技术与术后组织病理学检查具有同等精确度。
图4、Visser等[4]证实OSNA技术与与术后组织病理学检查具有同等的精确度，并对OSNA与组织病理结果不一致的前哨淋巴结进一步分析，发现15例标本组织病理阴性而OSNA阳性，有11例CK19拷贝数接近临界值；进一步通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和/或蛋白质印迹法对这15例标本进行分析，发现其中7例标本有CK19的表达。在调整不一致结果后，OSNA与组织病理的一致率达96.8%，敏感度达97.1%。
图5、Schem等[5]对93例乳腺癌患者的例腋窝淋巴结进行了分析。在对不一致病例调查后总结OSNA与组织病理学检查的一致率、敏感度、特异度分别为95.5%、%、95.6%。
目前OSNA技术已获得中国、日本及欧洲多个国家的市场准入资格，广泛应用于临床。而且日本、英国、西班牙、意大利、法国等国家已将OSNA技术作为前哨淋巴结活检的推荐方法列入乳腺癌临床实践指南。
图6、OSNA技术已进入多国治疗指南
国家
指南/会议
发布时间
日本
日本乳腺癌学会乳腺癌临床实践指南[6]
西班牙
西班牙乳腺病理学会乳腺癌前哨淋巴结活检共识[7]
西班牙妇产科学会乳腺癌临床实践指南[8]
英国
英国NICE乳腺癌诊断指导意见[9]
意大利
意大利肿瘤内科学会乳腺癌指南[10]
意大利乳腺病理学组推荐意见[11,12]
法国
尼斯乳腺癌管理临床实践推荐意见第六版[13]
在国内，医院、医院、医院、医院、医院开展前瞻性多中心临床观察[14]对例原发乳腺癌患者的枚淋巴结进行研究，OSNA的准确度、敏感度、特异度分别为91.4%（/）、83.7%（/）和92.9%（/），其敏感度优于快速冰冻病理（59/76比53/76，P=0.），显著优于印片细胞学（/比/，P=0.）。对于前哨淋巴结微转移，OSNA的敏感度优于快速冰冻病理（8/17比4/17，P=0.），显著优于印片细胞学（30/48比17/48，P=0.）。OSNA的平均操作时间为37.3分钟（手动匀浆），证实OSNA检测快速、易于操作，具有较高的准确度，其敏感度优于快速冰冻病理和印片细胞学，可作为前哨淋巴结术中诊断的选择之一在国内推广应用。
图7、各中心OSNA平均操作时间（分钟，手动匀浆）
随后，医院、天津医院、医院针对例原发乳腺癌患者的验证研究[15]同样证实了OSNA技术与术后组织病理学检查具有同等的精确度。
近年来，随着OSNA技术推广及研究深入，越来越多的研究利用OSNA定量值来辅助临床决策。
Shimazu等[16]便利用OSNA建立了乳腺癌患者预后模型，该研究对例T1-2N0M0雌激素受体阳性HER2阴性乳腺癌患者分别采用OSNA和组织病理方法检查，并对阴性患者进行长达6年的随访。结果显示，由于OSNA检出微转移的优势，故OSNA组与组织病理组相比，6年无远处复发生存率显著较高（99.5%比90.1%，P=0.），显示出OSNA技术对前哨淋巴结阴性乳腺癌患者具有良好的预测作用。
图8、OSNA作为预后指标的前瞻性研究
Peg等[17]还利用OSNA将患者分层。该研究将每位患者的全部前哨淋巴结用OSNA测定的CK19mRNA拷贝数进行累加，定义为总肿瘤负荷，以拷贝/μL为阈值，将患者分为低风险组与高风险组，两组患者的无病生存、无局部复发生存、总生存具有显著差异，因而确定前哨淋巴结总肿瘤负荷是不依赖于腋窝病理淋巴结分期、年龄和肿瘤特征（大小、分级、淋巴血管浸润）的独立预后因素。
图9、按前哨淋巴结总肿瘤负荷进行生存时间曲线分析
注：高风险组患者（红色曲线，总肿瘤负荷拷贝/μL）与低风险组患者（黑色曲线，总肿瘤负荷拷贝/μL）相比，无病生存、无局部复发生存、总生存具有显著差异。
在国内，王永胜教授团队[18]还利用OSNA建立了乳腺癌非前哨淋巴结转移的预测模型。该项研究利用年OSNA临床试验入组的例患者中前哨淋巴结阳性并接受腋窝淋巴结清扫的例患者数据，对年OSNA临床试验入组的例患者中61例符合相同条件的患者数据进行验证。结果显示，原发肿瘤大小、前哨淋巴结总肿瘤负荷、前哨淋巴结阳性数及阴性数是非前哨淋巴结转移的四个独立相关因素，利用这四个因素建立预测列线图，得出建模组患者的受试者工作特征曲线下面积为0.，验证组患者的受试者工作特征曲线下面积为0.，证实基于分子诊断的乳腺癌非前哨淋巴结转移预测模型既可以术中快速预测腋窝淋巴结转移风险，也可以术后常规预测，明显优于其他预测模型，对后续腋窝处理及放疗靶区勾画具有更好的指导价值。
图10、基于OSNA技术预测非前哨淋巴结转移列线图
近年来，随着新辅助治疗在乳腺癌治疗领域中的应用，为乳腺癌患者的临床降期带来可能，使不可手术变为可手术、不可保乳变为可保乳。然而乳腺癌患者新辅助治疗后，常常伴有淋巴结纤维化、萎缩及组织学改变，为病理医生的取材、诊断增加了难度[19]。
图11、乳腺癌新辅助治疗后的淋巴结状态
日本Osako等[20]对80例新辅助治疗后患者的枚淋巴结进行分析，结果显示与组织病理相比，OSNA分析的准确度、敏感性和特异性分别为91.1%、88.3%和91.7%，其中66枚（21.9%）出现化疗诱发的组织学改变，而OSNA对这些淋巴结检测的准确率、敏感性和特异性分别为90.9%、88.9%和93.3%，证实虽然存在化疗诱发的组织学改变，但是OSNA仍可以像组织病理一样精准地检测到肿瘤负荷。
图12、化疗诱发的组织学改变及OSNA的表现
Espinosa-Bravo等[21]对～年连续例接受新辅助治疗的乳腺癌患者进行多中心研究，其中例患者术中接受了快速冰冻病理检查，例患者术中接受了OSNA检查。结果显示，快速冰冻组44例、OSNA组48例患者存在前哨淋巴结转移（26.5%比31.2%，P=0.4）。OSNA对微转移和孤立肿瘤细胞的检出率优于快速冰冻（36.3%比20.5%、11.4%比4.5%）。其中10例术中快速冰冻阴性患者术后病理评估阳性（18.5%）而需要第二次手术进行腋窝淋巴结清扫，OSNA检测结果与术后病理相似（P=0.5）。因此，在新辅助治疗后，OSNA可像术后病理检测一样精准地检测出前哨淋巴结转移，减少腋窝淋巴结清扫第二次手术的必要性。
图13、研究流程图
OSNA技术的适应证不仅局限于乳腺癌淋巴结检测，国外越来越多的研究证实OSNA技术对于胃癌[22-27]、结直肠癌[28-37]、肺癌[38-45]等多种肿瘤的淋巴结检测均有良好表现。
图14、OSNA技术在其他肿瘤中的评估数据
关于成本效益，医院也开展了一些回顾研究。西班牙Guillén-Paredes等[46]针对45例采用常规术后组织病理检查和35例采用OSNA检查的患者就每位患者平均手术时间、住院时间和住院费用进行回顾分析，结果显示，OSNA检查组与常规病理检查组相比，患者的住院天数和手术时间显著较短，住院期间总成本平均节省.67欧元。法国Raia-Barjat等[47]也开展了类似研究，证实OSNA检查组与常规病理检查组相比，虽然平均检查成本显著较高，但是平均住院时间显著较短，总成本平均节省.7欧元。因此，OSNA技术不会增加住院总成本，而且还减少了20%的患者再次接受手术。
年，国家卫生健康委员会医政医管局分别对全国家医院进行质量抽查[48]，其中家医院无病理科设置或未开展病理业务，医院的59.9%；资料完整、医院共家，平均每张病床病理医师数量为0.55、病理技术人员数量为0.46，约24.4%的病理科仅有1名病理医师，46.3%医院病理科仅有1名病理医师，医院医院术中快速诊断开展率和平均数量，医院，病理医师与技术人员的严重缺乏成为制约病理学发展的重要因素。根据乳腺癌前哨淋巴结活医院开展的现状和障碍的调查分析[49]，术中快速冰冻病理时间太长、假阳性或假阴性率过高，也是目医院乳腺外科医师的重要原因。OSNA技术采用自动化检测设备，经过培训和10例左右的学习曲线，普通实验室人员可以在40分钟内完成检测，大大降低了病理医师前哨淋巴结检测的工作负担，把术中宝贵的时间节省下来做更需要的原发灶和切缘诊断。
未来，随着技术的发展，越来越多的分子诊断新技术进入病理检查领域，其快速、精准、易于操作、可重复性强等特点可大大降低病理检测的工作量，未来甚至有可能改变现有术中诊断模式。
参考文献
[1]vandeVrandeS,MeijerJ,RijndersA,etal.Thevalueofintraopera-tivefrozensectionexaminationofsentinellymphnodesinbreastcancer.EurJSurgOncol.;35(3):-.
[2]TsujimotoM,NakabayashiK,YoshidomeK,etal.One-stepnucleicacidamplificationforintraoperativedetectionoflymphnodemetasta-sisinbreastcancerpatients.ClinCancerRes.2;13(16):-.
[3]TamakiY,AkiyamaF,IwaseT,etal.Moleculardetectionoflymphnodemetastasesinbreastcancerpatients:resultsofamulticentertrialusingtheone-stepnucleicacidamplificationassay.ClinCancerRes.;15(8):-.
[4]VisserM,JiwaM,HorstmanA,etal.Intra-operativerapiddiagnosticmethodbasedonCK19mRNAexpressionforthedetectionoflymphnodemetastasesinbreastcancer.IntJCancer.;(11):-.
[5]SchemC,MaassN,BauerschlagDO,etal.One-stepnucleicacidamplification-amolecularmethodforthedetectionoflymphnodemetastasesinbreastcancerpatients;resultsoftheGermanstudygroup.VirchowsArch.;(2):-.
[6]HoriiR,HonmaN,OgiyaA,etal;JapaneseBreastCancerSociety.TheJapaneseBreastCancerSocietyClinicalPracticeGuidelineforpathologicaldiagnosisofbreastcancer.BreastCancer.;22(1):59-65.
[7]BernetL,PineroA,Vidal-SicartS,etal.Consensusonsentinellymphnodebiopsyinbreastcancer.ReviewoftheSpanishSocietyofSenologyandBreastPathology.RevSenolPatolMamar.;27(1):43-53.
[8]SociedadEspanoladeGinecologíayObstetricia.Guíasprácticasclínicaencáncerginecológicoymamario.