非洲猪瘟来中国后呈现出摧枯拉朽的势态，迅速席卷大江南北，给中国养猪业致以沉重一击。国人的膳食结构中动物蛋白的主要来源是猪肉，所谓“猪粮安天下“。现在养猪从业者除了加强自己猪场生物安全及小范围的联防联控，就是期待着科研工作者在”集中力量办大事“的机制下早日攻克难关，推出安全、高效、稳定的疫苗。5月25日中国农业科学院通报哈尔滨兽医研究所自主研发的非洲猪瘟疫苗取得了阶段性成果无疑是养猪同仁们的打了一针强心剂。6月11日，一则上市公司发布“不低于92%”有效预防率的非洲猪瘟疫苗已经“研制成功”并“准备投产”公告引发了养猪从业人员的热烈讨论。
作为并非在抗非瘟一线的我，愿用我的专业特长为“抗非战瘟”的一线战友送上些许“弹药”。希望接下来尽可能多的翻译出这类文章，供行业同仁们一起交流、探讨。也请行业大咖多指教。
JoseA.Barasona1*?,CarminaGallardo2?,EstefaníaCadenas-Fernández1,CristinaJurado1,BelénRivera1,AntonioRodríguez-Bertos1,3,MarisaArias2andJoseM.Sánchez-Vizcaíno1
·1西班牙马德里孔普滕斯大学VISAVET健康监测中心兽医学院动物健康系1AnimalHealthDepartment,FacultyofVeterinary,VISAVETHealthSurveillanceCentre,ComplutenseUniversityofMadrid,Madrid,Spain
·2西班牙马德里动物研究中心(INIA-CISA)欧盟ASF参考实验室2EuropeanUnionReferenceLaboratoryforASF,CentrodeInvestigaciónenSanidadAnimal(INIA-CISA),Madrid,Spain
·3西班牙马德里孔普滕斯大学兽医学院动物医学与外科系3DepartmentofAnimalMedicineandSurgery,FacultyofVeterinary,ComplutenseUniversityofMadrid,Madrid,Spain
关键词：减毒ASF病毒，疾病控制，欧亚野猪，经口免疫，保护性疫苗
引证：
BarasonaJA,GallardoC,Cadenas-FernándezE,JuradoC,RiveraB,Rodríguez-BertosA,AriasMandSánchez-VizcaínoJM()FirstOralVaccinationofEurasianWildBoarAgainstAfricanSwineFeverVirusGenotypeII.Front.Vet.Sci.6:.doi:10./fvets..00
摘要
非洲猪瘟（ASF）是全球养猪业面临的最大威胁，已蔓延至三大洲55个国家，影响了世界上77％以上的猪群。在欧盟，野猪（Susscrofa）是受影响最严重的宿主。ASF在欧洲空前、不断传播的主要原因包括贸易活动、各地区间受感染野猪群的迁徙以及缺乏预防ASF的疫苗。在这项研究中，我们证明用年在拉脱维亚分离的II型非血细胞吸附、减毒ASF病毒（Lv17/WB/Rie1）对野猪进行经口免疫，可产生针对强毒性ASF病毒分离株（Arm07）攻毒的92%的保护性。据我们所知，这是经口免疫有望对抗野猪ASF病毒的首次报道。还需进一步的研究评估重复免疫和过量免疫的安全性，确定其长期散毒的特征，并验证疫苗病毒的遗传稳定性，以确认Lv17/WB/Rie1是否可用于ASF控制计划中的自由放养野猪。
背景介绍
非洲猪瘟（ASF）是影响猪科动物的最复杂和最具毁灭性的病毒性疾病之一。强毒力ASF毒株可导致受感染动物出现急性或极急性出血热，死亡率高达％（1）。由于其对社会经济和动物健康造成的灾难性后果，ASF被世界动物卫生组织列为法定报告传染病。从东非引入格鲁吉亚（2）后，ASFVII型自，和年以来分别在东欧、欧盟和亚洲持续传播(3)。尽管已执行了各种控制措施，野猪和家猪的非洲猪瘟案例还是不断发生(3)。现在既无针对ASFV的疫苗也无行之有效的特定治疗方法。控制措施包括对受感染的野猪和家猪清群，以及从区域、国家和世界层面对生猪和猪制品的交易流通进行限制(1,4,5)。因此，ASF是当前全球养猪业面临的最大威胁(6,7)。
目前，ASF影响了包括中国在内的3大洲的55个国家，而中国的生猪产量占世界生猪总量的近一半。ASF的流行病学特征因流行毒株的特征、是否有野生宿主、猪场生物安全、环境条件和人类行为的不同而存在显著差异(4,8)。在过去5年中，有9个欧盟成员国报告了ASF，包括立陶宛、波兰、拉脱维亚、爱沙尼亚、捷克、罗马尼亚、匈牙利、保加利亚和比利时(3)，其中，除罗马尼亚外，在其他8国野猪均是主要宿主，野猪案例超过欧盟总案例的90%以上(3)。爱沙尼亚的流行病学分析得出结论，野猪群中存在的ASF是家猪ASF爆发的主要风险因素(9)。
受感染猪的非法转运、引入被ASFV污染的猪肉或猪肉产品以及餐厨剩余物喂猪都会导致ASF的跨境转移(1,10)。虽然这些是ASF长距离传播的主要风险因素(2,11)，但受感染的自由活动的野猪可通过天然相连的地理环境使ASF在局部地区持续感染或传播，这就使得ASF在欧盟野猪群中持续流行。
ASF的临床表现多种多样，从急性到亚临床不等。临床表现取决于毒株的毒力、宿主、剂量和感染途径等因素。潜伏期从3天至19天不等(13)。临床症状和病变包括充血、败血和血液动力学变化如出血、水肿、腹水、休克，以及消化系统和呼吸系统的功能障碍(8)。死亡率从10%至%不等，这取决于毒株的毒力(1)。欧亚案例中的ASFVII型毒株是强毒力毒株，并且会引起急性临床形式，导致家猪野猪近%的死亡率(14-17)。最近的报告还表明，中等毒力的ASFV毒株正在欧洲流行(18,19)。
总的来说，ASFV的结构复杂、对ASFV感染和免疫的认知匮乏、缺乏典型中和抗体、以及缺乏稳定的细胞株等技术困难都是ASF疫苗开发的障碍。事实上，疫苗开发已被认为是ASF控制和净化的一个主要缺口(13)。
最近ASF在欧洲的再度出现引发了行业对开发一种有效的ASF疫苗的兴趣。使用灭活病毒或亚单位疫苗的尝试未能诱导产生保护性免疫(20-22)。通过细胞培养连续传代或基因缺失减毒的活疫苗可诱导部分或完全保护(20,23)。在确定ASFV基因毒力和免疫逃避方面的重大进展促进了候选减毒疫苗的工程设计。事实上，目前已有几个ASFV基因组序列可用(24)。自然减毒活疫苗候选毒株也可以从田间分离出来(25)。年在拉脱维亚从一头被猎杀的野猪中分离到一株弱毒力、非血细胞吸附ASFV毒株(Lv17/WB/Rie1)(25)。该毒株对家猪的实验感染产生了对强毒力、血细胞吸附ASFVII型毒株的完全保护，表明Lv17/WB/Rie1可能成为一种减毒活疫苗的可行性(25)。
尽管行业对野猪的ASFV疫苗非常感兴趣，但我们所知道的疫苗接种试验只有针对家猪的(见附表1中的参考文献)。在-年间，经典猪瘟波及欧洲多个国家，证明了免疫野猪的重要性(26)。本实验研究的目的是评估用Lv17/WB/Rie1毒株经口免疫野猪对强毒力ASFVII型分离株(Arm07)的抵抗能力。
研究材料和方法
实验动物
本实验使用了18头3-4个月大、10-15公斤重的雌性野仔猪。这些仔猪来自西班牙埃斯特雷马杜拉的一个商品野猪场，没有免疫过任何传染病疫苗。检测表明，本场的野猪对该地区常发的重要猪病原都是阴性，包括伪狂犬病毒、牛分枝杆菌、肺炎支原体及猪圆环病毒2型。这些仔猪被饲养在马德里孔普滕斯大学VISAVET中心的BSL-3的生物安全防护设施内。实验开始前，这些野猪经过了两周的驯化适应期。在实验期间，它们可以自由采食和饮水。所有实验都是遵照欧洲、国家和地区的法规进行的，并得到马德里自治区伦理委员会（EthicCommitteeofComunidaddeMadrid）的批准(参考批号PROEX/18)。
ASFV分离株
本实验使用了减毒、非血细胞吸附的p72基因型II非洲猪瘟疫苗lv17/wb/rie1。该毒株已在家猪上进行过试验(25)。其独特的非血细胞吸附表型与一种独特的腺苷清除有关，可从EPR基因中的CD2样编码序列产生截短蛋白(西班牙专利PCT//)。这一缺失对应格鲁吉亚/1血细胞吸附ASFV参考基因组(GenBankFR)中的基因位置。病毒在猪单核细胞中培养7天(26)，然后收集含有胞外型病毒的培养基，低速离心去除细胞碎片，高速沉淀病毒。将沉淀物悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在猪血液单核细胞中滴定，用于保护实验。病毒滴度定义为50%感染培养物(TCID50/ml)中引起细胞病变的病毒量，通过免疫过氧化物酶染色估计。
在攻毒实验中，使用了强毒力、血细胞吸附ASFVII型毒株Arm07(23)，病毒在猪血液单核细胞中培育(23)。病毒滴度定义为50%感染培养物中引起血细胞吸附的病毒量(HAD50/ml/TCID50/ml)。
野猪免疫接种和攻毒
12头野仔猪在BSL-3实验室进行了疫苗接种试验。最初，9头仔猪口服TCID50的Lv17/WB/Rie1ASFV进行接种。随后，其余3头野猪（以下称为VContact）分别在接种后第0,7和15天与最初经口免疫的野猪进行接触，以测试不同时间的疫苗毒传播情况。
疫苗接种期持续30天以产生免疫应答。之后，采用散毒猪-猪攻毒-暴露感染模型来评估保护性免疫：免疫的猪被暴露于4头阴性野猪（感染后散毒猪）。这些阴性野猪在同一天肌内接种了10HAD50的ASFVArm07，作为肌内攻毒对照组。接种30天后，2头阴性野猪被用作晚期接触动物暴露于其他所有猪，并测量疫苗或攻毒病毒的传播情况。
这12头接种的野猪和4头用Arm07进行肌内攻毒的野猪以及2头晚期接触野猪在攻毒后观察24天，即相当于疫苗接种后54天。
在此期间，动物的运动每天24小时用摄像机监控。每天记录临床症状(5,23)，包括厌食症、伏卧、皮肤出血或发绀、关节肿胀、呼吸困难、眼分泌物和消化不良。每周两次各收集一对EDTA抗凝血样和血清样本。在对动物进行取样前，以及对接种疫苗后出现任何临床症状的动物，每周测量两次直肠温度。采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测血液中ASFV基因组的存在情况(27)。使用商业ELISA试验((Ingenasa-IngezimPPACompacK3;Ingenasa,Madrid,Spain)和间接免疫过氧化物酶实验(IPT)检测血清抗体(13)。
剖检和采样
观察期结束时（免疫后54天），存活的猪用替来他明-唑拉西泮（tiletamine-zolazepam,Zoletil?mg/ml,Virbac,France,靶剂量3mg/kg）和美托咪定（medetomidineMedetor?,Virbac,France,靶剂量0.05mg/kg）进行复合麻醉(28)，然后静脉注射T61安乐死。随后对这些猪进行了全面的剖检，以检查与ASF相关的肉眼病变。每头剖检的猪取16个不同的组织样本（见表1）进行Real-timePCR检测ASFV，样本包括所有主要淋巴结和靶脏器。并用已有程序从组织样本中分离病毒(29)。样品盲传三代，六天内测试其血凝价。如果发现ASF相关病变，则根据病变分布和程度对其进行分类。
图1：使用实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒DNA的组织样本清单
采样组织
骨髓
纵膈淋巴结
脑
肠系膜淋巴结
胃肝淋巴结
肩胛骨前淋巴结
心脏
肾淋巴结
腹股沟淋巴结
咽后淋巴结
肾
脾脏
肝
颌下淋巴结
肺
膀胱
统计分析
分别采用Kaplan-Meier生存曲线和Mantel-Cox时序检验计算死亡概率和检验各组生存差异是否显著。采用曼-惠特尼U检验（Mann-WhitneyU）和斯皮尔曼等级相关系数（Spearman’srankcorrelation）对比处理组间Real-timePCR的Ct值。数据采用SPSS20(IBM,Somar,NY,USA)进行分析，显著性水平为0.05。
结果
疫苗接种期间的结果
在30天的疫苗接种期内，9头经口免疫的野猪中有6头在疫苗接种后15±3天通过ELISA和免疫组化试验(IPT)检测ASFV抗体阳性（图1）。3头Vcontact野猪在接触后14±2天均出现阳性抗体反应，整个实验期间抗体滴度保持较高（图1）。这些结果表明，经口免疫Lv17/Wb/Rie1毒株能诱导野猪的抗体应答。
图1
图1：口服Lv17/WB/Rie1疫苗的野猪(灰色)和与通过接种感染的野猪(蓝色)的ASFV抗体水平。后者在前者接种疫苗后第0天(ID7)、7天(ID10)和15天(ID17)分别开始接触。抗体水平用间接免疫过氧化物酶法测定。
在用Lv17/WB/RIE1免疫的动物中未发现与ASF相似的临床症状。检测到的唯一临床反应是9头免疫动物中的7头和3头VContact动物中的1头体温略微升高到40.1-40.8度，这种情况在接种后的4-24天内平均持续3.5天（图2）。病毒血症在不同动物体内达到高峰的时间不同。9头口服疫苗动物中的6头和3头Vcontact动物中的2头，在30天的疫苗接种期间，Real-timePCR偶尔显示弱阳性结果(CT=33.02±4.07)。病毒血症峰值与体温的轻微升高呈弱相关关系（图2）。
图2
图2：口服Lv17/WB/Rie1的动物的临床平均评分、体温和Real-timePCR的Ct值(n=9;深蓝色)，VContact动物（n=3;浅蓝色)，用强毒力ASFVArm07毒株肌内攻毒的对照动物(n=4;红色)和晚期接动物(n=2;灰色)。图中显示的是接种后不同天数（dpv,包括攻毒后天数dpc）的平均值。误差条表示标准偏差。
攻毒后结果
疫苗免疫和Vcontact动物产生的免疫应答会对Arm07产生保护。12只疫苗免疫和接触攻毒的存活动物中，有11只(92%)在攻毒-暴露后存活下来。并且，攻毒后，它们都没有出现任何ASF相关的临床症状或肉眼病变。在30天的疫苗接种期间，有2只口服疫苗免疫的动物既没有表现出ASFV抗体反应，也没有体温升高，但在接种后出现间歇性病毒血症高峰。它们分别在接种后3天和7天（也即免疫后第33天和37天）出现阳性抗体反应。
相比之下,所有对照组动物在接受肌内攻毒后都产生了与非洲猪瘟相关的严重的临床症状(图2)。这些猪或因感染死亡，或在感染后7至20天安乐死(Mantel-Cox,χ2=18.d.f.;p0.)。两只晚期接触动物的临床症状与对照组肌肉攻毒的猪相似(图2)，只是晚期接触动物在攻毒后7天和9天出现抗体应答，随后恢复到攻毒前的状态并存活下来。口服疫苗后死亡的那只野猪，出现了与对照组肌内攻毒的野猪相似的非洲猪瘟临床症状。这只野猪从未出现抗体应答。
所有肌内攻毒的对照动物在感染后6-12天开始出现病毒血症，直至死亡(Ct=23.65±4.68)。2只晚期接触动物分别在攻毒后6天和11天，出现病毒血症(Ct=32.74±1.11)，持续至21天。8只口服疫苗存活的动物中有4只和3只VContact动物中有1只在攻毒后出现微弱的病毒血症高峰(Ct=34.56±1.60)。口服疫苗但未产生保护的那只野猪出现的病毒血症的Ct值与肌内攻毒的对照组相似(Ct=26.31±1.73)。总的来说，Real-timePCR检测的存活动物的病毒血症Ct值明显高于未产生保护的那只野猪或肌内攻毒的对照组动物(Mann-WhitneyUtest,Z=-2.84,p0.01)(图2)。
剖检分析显示，只有在接种了疫苗但未产生保护的野猪和肌内攻毒的对照组动物中发现了ASF相关的病理反应。剖检主要表现为腹腔(腹水)、胸腔(胸腔积液)和心包(心包积液)中度至重度积液，由淡黄色至淡红色不等。肺表面、脾脏(脾肿大)、淋巴结(出血性淋巴结炎)、肾脏、膀胱粘膜(弥漫性出血性膀胱炎)和胃粘膜均可见充血和局灶性出血（图3和4）。
图3：(A)口服Lv17/WB/Rie1疫苗的野猪的胸腔和腹腔，(B)用强毒株ASFVArm07肌内攻毒的对照组。胸腔积液、肝肿大和脾肿大在(B)中很明显。
图4：(A)口服Lv17/WB/Rie1疫苗的野猪的心包(I)、肾脏(II)和肠粘膜表面(III)；(B)用强毒株ASFVArm07肌内攻毒的对照组。(B)出现心包积液(IB)，肾充血并伴有皮质表面急性多灶性瘀点到瘀斑性出血(IIB)，以及结肠粘膜表面有大量急性瘀点(IIIB)。
图3
图4
在8只口服疫苗存活动物中的3只和3只VContact动物中的2只的16份组织中，没有检测到ASFV基因组DNA。其余存活动物平均5个组织PCR呈弱阳性(Ct=38.±1.16)。这些动物的22个组织样本中只有两个能分离到ASFV：一个疫苗免疫动物的咽后淋巴结和一个VContact动物的肾淋巴结。这些分离株为非血细胞吸附型。两头晚期接触动物在分别有9个和12个组织为PCR弱阳性(Ct=37.40±0.43)，仅有1个腹股沟淋巴结分离出血细胞吸附ASFV。相比之下，4只肌内攻毒动物的16个组织中几乎全部检测到病毒DNA，并且水平显著高于存活动物(Ct=21.59±1.26)(Mann-WhitneyUtest,Z=-2.65,p0.01)。也从多个组织中分离出了血细胞吸附ASFV。同样，经口免疫后未产生保护的那只野猪，其所有16个组织中均表现出强阳性PCR结果(Ct=23.32±1.60)。详细结果见图5。病毒基因组载量与最后检测到的病毒血症和剖检分析之间的时间间隔呈负相关(斯皮尔曼等级相关系数Spearman’srankcorrelation,r=-0.,p0.;图6)。
图5：检测动物剖检组织中ASFVDNA水平(实时PCR的Ct值)。深蓝色：Lv17/WB/Rie1经口免疫动物；浅蓝色：VContact动物；红色：强毒力毒株ASFVArm07肌内攻毒对照组动物；灰色：晚期接触动物。未存活下来的唯一经口免疫的动物(ID11)在几个组织中均显示出强阳性结果(Ct=23.32±1.60)，这与肌内攻毒的对照组相似。
图5
图6
图6：16个组织样本中的ASFVDNA水平对比(Real-timePCR的Ct值)，从最后检测到病毒血症到剖检的天数。Ct值与病毒基因组水平呈负相关。
讨论
在实验条件下，以一株天然减毒的ASFV分离株(Lv17/WB/Rie1株)(25)作为候选野猪疫苗进行了试验。由于这种疫苗的目标是野外野猪，我们认为通过口服给予这种原型疫苗非常有意义，过去的成功经验也证明了这一点(在德国用经口免疫野猪经典猪瘟)(30)。我们的研究结果表明，Lv17/Wb/Rie1毒株在经口免疫动物和Vcontact动物中对强毒力分离株ARM07的攻毒产生92%的保护力。这种保护作用不仅表现为动物感染后能存活，也表现为未出现与ASF相关的临床症状，目标组织中也未发现病理变化和病毒。该候选疫苗将是首个在野猪体内测试的抗ASFVII型的口服疫苗。这种疫苗在田间的使用目的是减少易感动物的数量，增加野猪群的群体免疫力，从而降低ASF的发生率。
这项完整的体内研究提供了临床发现和16个目标组织与器官的病理发现、抗体反应、病毒血症周期和DNA病毒检测的细节。当将这些结果与之前在国内猪身上测试的候选疫苗的实验研究进行比较时，突出显示了针对非亲本强毒力ASFVII型毒株攻击的保护效力（见附表1）。虽然本研究各组间动物数量并不均衡，但本研究中观察到的对野猪的高保护作用与之前用Lv17/WB/Rie1对2只家猪进行肌内攻毒和4只晚期接触动物的结果一致(25)。因此，这种天然分离株似乎比其他通过细胞内连续传代(31)或通过对非亲本病毒(32-34)进行基因编辑而减毒的毒株更有效。从这个意义上说，需要进一步研究Lv17/WB/Rie1对不同的ASFV基因型的交叉保护作用，因为本研究中作为攻毒毒株的ASFVArm07也属于基因型II。
通过基因工程获得ASF减毒活疫苗的研究有很多，可以考虑作为一种改进候选疫苗的潜在工具，使我们能够敲除毒力基因，从而最大限度地提高安全性。然而，我们必须记住，一些基因有重要的保护作用，应该保留。与减毒的ASFVNH/P68株一样，它对Arm07毒株具有完全的保护作用，但经过基因编辑后，迄今检测到的缺失变异株并没有显示出它们能完全抵御异源强毒株挑战的能力，从而降低了这些候选毒株的效力(23)。
通过对3头野猪的接触免疫观察表明，经口服疫苗接种的动物可以散毒。这种散毒也见于候选疫苗减毒毒株ASFVNH/P68(23)，可能有助于扩大疫苗保护范围，减少高昂的生产成本和田间大规模的疫苗免疫。
另一方面，疫苗毒的散毒可能意味着从ASF中恢复的野猪充当了病毒携带者，让病毒持续感染(18,19,35,36)。然而，两项长期研究表明，在ASF临床康复后，感染中等毒力ASFV的动物能够从血清和组织中清除病毒，并且不会将病毒传播给与之混合的哨兵猪(37,38)。事实上，存活的动物在初次感染后3个多月的时间内抗体水平都很高(37)。这些结果与我们的研究结果一致，口服疫苗免疫的动物和VContact动物保持了较高的抗体滴度(图1)，而病毒血症(图2)和组织中的病毒DNA(图6)在实验期间下降，即使在暴露于强毒株攻毒后也是如此。在试验最后，在所有的经口免疫和Vcontact动物中，我们仅从2个组织中分离出了非血细胞吸附Lv17/WB/Rie1毒株，这表明病毒血症期后(25)的感染风险较低（尽管我们认为这只是个初步结果，因为我们并没有尝试从所有的可用组织中分离病毒）。此外，迫切需要进行长期研究来评估Lv17/WB/Rie1在哨兵野猪中的存活和传播能力。这一点尤其重要，因为有关于动物作为ASFV携带者的能力的相互矛盾的研究，这个能力这可能取决于病毒毒株(18,19,35-38)。还需要进一步的研究来评估Lv17/WB/Rie1作为疫苗的安全性，例如，确定当动物接受过量的剂量时会发生什么，以及检查病毒随时间的传播途径(20,39,40)。
在对剖检组织的PCR检测中，8只口服疫苗存活动物中的3只和VContact动物中的2只无法检测到ASFVDNA，这表明这些动物已经完全消除了病毒。其余存活动物主要在咽后和颌下淋巴结中显示弱阳性PCR结果，表明这些动物尚未消除疫苗病毒，或者它们可能已经消除了病毒，但又被之前病毒血症期间留在猪栏里的病毒重新感染了。这种病毒很可能是Lv17/WB/Rie1，因为从这些存活的动物中分离出来的所有病毒都是非血细胞吸附型的。相比之下，肌内攻毒的对照组和一只接种了疫苗但未产生保护的野猪在所有分析的组织中都显示出PCR强阳性结果(见图5)，这个病毒DNA最有可能是攻毒毒株Arm07，因为该病毒分离株具有血细胞吸附性。这些研究结果表明，Lv17/WB/Rie1病毒可以被消除，并且在长期内不能有效传播，至少在本研究的剂量和给药途径上是如此。与此观点一致的是，病毒DNA水平与最后检测到的病毒血症和剖检之间的间隔呈负相关(图6)。
我们的分析表明，接种疫苗帮助了这两头晚期接触动物从ASFV感染中恢复。攻毒后初期，其病毒血症、体温及临床症状与肌内攻毒动物相似(图2)，甚至有一只晚期接触动物的腹股沟淋巴结分离出了血细胞吸附ASFVArm07毒株。然而随后，这两只晚期接触动物分别在攻毒后7和9天表现出较高的抗体反应，临床症状和病毒血症也减少(图2)。我们观察到，两只晚期接触动物的组织中都存在ASFVDNA，与口服疫苗和VContact存活动物类似(图5)，这可能反映了晚期接触动物同时暴露于两种分离株。事实上，晚期接触动物的临床恢复和病毒的消除表明Lv17/WB/Rie1可能是一种高效疫苗，因为即使在存在强毒Arm07分离株的情况下，它也能提供保护。这些结果需要进一步使用攻毒毒株和疫苗毒对动物攻毒以验证和推广。
据我们所知，这是第一个关于用ASFVII型对野猪进行实验接种的报告，也是第一个关于对野猪进行任何ASFV毒株的经口免疫的报告。在目前这种跨界疾病的背景下，迫切需要一种口服疫苗来预防野猪中的ASFV，用以加强和重新设计缓解计划的附加工具，因为目前为止对受影响野猪群采取的控制措施没有一项是有效的(7,13,41)。如果能够确定Lv17/WB/Rie1作为疫苗的安全性，那么它可能有助于缓解ASFV在欧洲的不受控制的传播局面，类似于迄今为止在阻止经典猪瘟传播方面取得的成功。未来的研究应检查重复免疫或过量免疫后疫苗的安全性、传代期间的遗传稳定性、田间稳定性以及基于DIVA血清学检测与感染病毒的区别。
作者贡献
JB、CG、EC-F、MA、JS-V:参与实验设计。CG,BR,MA:制备疫苗。JB、CG、EC-F、CJ、BR、AR-B和JS-V:进行田间和实验室工作。JB、EC-F、CJ、BR和JS-V:进行数据分析。JB,EC-F，和CJ:起草手稿。CG,BR,AR-B,MA，和JS-V:订正手稿。
经费
本研究工作得益于RTA--C02-02(INIA)项目的资助。JB由MINECO公司的JuandelaCierva合同支持(FJCI--和IJCI--)。CJ和EC-F是西班牙教育、文化和体育部为培养未来学者提供的西班牙*府资助的博士奖学金的获得者。
利益冲突声明
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以被解释为潜在的利益冲突。
致谢
作者要感谢所有参与研究开发、动物取样和数据收集的人员，特别是SUAT和VISAVET团队。
补充材料
本文的补充材料可通过以下链接在线获取：