快速、准确的病原学诊断，能尽早选择敏感的抗感染药物或采取有效、具有针对性的防控措施，是感染性疾病精准化防治的核心。宏基因二代测序作为一种新兴的检测技术，能够不依赖微生物培养而检出临床样本中的所有微生物，该技术已在国内被广泛应用，并展现了其快速、无偏倚和高检出的优势。
宏基因组二代测序（mNGS）已被广泛应用于感染性疾病的病原检测。然而，呼吸系统感染具有特殊性：病原组成复杂、标本类型选择多样、存在感染与定植、不同标本类型结果解读原则不尽相同等。为规范临床送检适应证，选择合适的送检标本以及恰当地解读报告，特组织专家对上述问题进行讨论并撰写专家共识，以期为呼吸系统感染中mNGS技术临床应用及报告解读提供专业的指导和帮助。
呼吸系统感染；宏基因组二代测序；结果解读；专家共识
呼吸系统感染是造成全球死亡人数最多的一类感染。年世界疾病负担研究学会的数据显示，下呼吸道感染（LRTIs）发病率和病死率在成人和儿童中位居第4位，年死亡人数达万。呼吸系统感染的病原体种类繁多，病原诊断困难，只有通过快速精准的病原体判断，并进行针对性的抗感染治疗，才能达到最佳的临床预后。虽然近年来分子生物学方法在感染性疾病病原检测中表现突出，但仍有50%左右的呼吸系统感染无法明确病原体。
宏基因组二代测序（mNGS）通过对临床标本进行宏基因组测序，可以无偏向性地检出标本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫），目前已被广泛应用于临床感染性疾病的病原检测，越来越多的临床研究及特殊病原体感染案例报道（特别是少见、苛养病原体）肯定了mNGS在感染性疾病辅助诊断中的价值，也不乏在呼吸系统感染中应用的研究。然而，目前临床送检适应证不明，检测质量参差不齐，报告解读也缺乏规范。不同于无菌腔隙，呼吸系统与外界相通，存在正常菌群，微生物组成尤为复杂，定植菌与感染菌的鉴别困难；不同呼吸系统感染类型优选标本类型也不同，不同的标本类型检测结果解读原则不尽相同，故呼吸系统mNGS临床应用及报告解读需要更专业的指导。目前我国已发表多个mNGS专家共识，但对临床上应用越来越广泛且结果解读难度较高的呼吸系统感染缺少专门介绍。为提高mNGS在呼吸系统感染病原诊断中的质量，规范临床送检适应证，选择合适的送检标本类型以及恰当解读报告，特邀请感染病学、呼吸病学、医院感染管理等领域的专家共同编写制订此共识。此共识适用于上呼吸道感染（病毒感染等）、LRTIs（肺炎、肺脓肿、支气管扩张伴感染等）和胸腔感染。共识内容旨在为临床样品送检和解读提供参考，不作为临床诊断标准流程。
1呼吸系统感染临床送检适应证
以下送检推荐，建议在送检mNGS的同时送检传统微生物检测。
推荐1：疑似LRTIs的危重症患者，建议送检mNGS。
由于现有常规微生物检测方法敏感度低、检测时间长及病原谱窄等因素的限制，LRTIs病原检出率低。重症LRTIs患者若得不到及时有效治疗，病情可迅速进展，甚至危及生命。重症肺炎中mNGS较传统方法病原检出率更高，可降低重症肺炎病死率。
推荐2：免疫功能抑制患者的呼吸系统感染，建议送检mNGS。
免疫抑制患者发生呼吸系统感染时，致病病原体较免疫正常患者更为复杂，且起病隐匿，进展快速，预后差，病死率高，故应特别重视，尽早明确病原学诊断。免疫抑制按机制主要分为粒细胞减少或功能障碍、体液免疫缺陷和细胞免疫缺陷三种类型，某些患者可能存在联合免疫抑制。在免疫抑制患者中，mNGS检测到的病原体更多，临床符合率高，能发现更多的真菌、病毒以及混合感染，如巨细胞病毒（CMV）合并耶氏肺孢子菌。
推荐3：疑似慢性肺部感染或难治性感染，且既往治疗效果不佳时，建议送检mNGS。
普通医疗机构对于慢性感染病原体及特殊病原体缺乏有效的检测手段。通常这类病原体检测耗时长、敏感度低或完全无法通过常规的培养及免疫学手段进行确诊。多个临床研究显示，mNGS在分枝杆菌［结核分枝杆菌（MTB）、非结核分枝杆菌（NTM）］、真菌（毛霉、曲霉）和厌氧菌等病原体检出优于传统培养。
推荐4：疑似呼吸道感染暴发且病原体不明，建议送检mNGS。
呼吸道感染暴发应采取准确、快速、全面的方法以尽快明确病原体，医院感染管理科、疾病预防控制中心等部门方可根据病原体采取有效的防控措施。对于新发病原体，mNGS具有传统培养及靶向分子诊断技术所不具备的优势。
推荐5：通过有创性操作获取的组织标本，如经皮肺穿刺组织、经支气管镜肺活检组织（TBLB）及经超声支气管镜淋巴结穿刺活检组织（EBUSTBNA）等，建议送检mNGS。
经皮肺穿刺活检术、TBLB、EBUSTBNA需在CT、X线透视或超声引导下进行，能够直接取到病变组织。但是，标本采集操作难度高、标本重复采集可能性低，目前包括组织病理、肺组织涂片、培养及其他分子生物学检查均有各自的局限性。因此，送检mNGS可提高病原诊断敏感度，通过不同检测方法组合，提高病原诊断率，尽早进行目标性治疗。
推荐6：怀疑厌氧菌引起的肺脓肿、坏死性肺炎或其他肺部感染，建议采集避免口腔菌群污染的标本（如下呼吸道标本、经皮穿刺肺活检组织及胸腔积液），送检mNGS。
厌氧菌培养需要绝对厌氧环境，且通常为合并感染，故常规培养阳性率低，由混合口腔厌氧菌所致慢性肺脓肿并不少见。多项研究发现，mNGS在厌氧菌诊断中具有优势，通过mNGS证实了如以微小单胞菌、具核梭杆菌等为主的混合厌氧菌感染病例。
2 呼吸系统感染送检标本类型选择
呼吸道感染标本类型的选择首先需考虑从原发感染部位采集，LRTIs更为复杂，肺部病灶部位、形态、大小、咳痰质量、有创操作耐受情况等均会影响选取最合适的标本类型。常见考虑送检的标本类型、采集要求、保存条件及特殊说明见表1。以下送检推荐，建议在送检mNGS的同时送检传统微生物检测。
推荐7：怀疑感染的肺部弥漫性病变，建议首选支气管肺泡灌洗液（BALF）；若无法耐受有创性检查，建议选择诱导痰、咳痰或者经上呼吸道吸痰标本。
对于LRTIs，最常见送检标本是BALF和痰。BALF直接取自下呼吸道，相较于痰标本黏稠、不均匀以及易被口咽部定植菌影响的短板，BALF直接取自下呼吸道，更推荐其作为LRTIs的首选标本。然而，收集BALF需进行有创的纤维支气管镜检查，需考虑患者耐受情况，咳痰、诱导痰或经上呼吸道吸痰标本可作为一种替代标本。虽然没有mNGS在同一患者的BALF与痰标本检出阳性率及临床符合率的研究，多个研究结果也证实了BALF在检出各种病原体中的优势。
推荐8：怀疑病毒性LRTIs者，建议同时送检下呼吸道标本进行DNA＋RNA检测。
病毒性肺炎的常见呼吸道病原体可分为RNA病毒及DNA病毒，以RNA病毒为主。常见的RNA病毒包括流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒和肠道病毒（如柯萨奇病毒、埃可病毒）等，DNA病毒常见腺病毒、CMV、单纯疱疹病毒等。行DNA和RNA检测所需标本保存条件有所区别，RNA容易降解，对标本的采集、保存和运输条件相对苛刻。当不能排除RNA病毒感染时，应考虑行RNA流程检测。DNA＋RNA检测流程可保证对包括RNA病毒在内的全部微生物类别进行检测覆盖。
推荐9：疑似病毒性LRTIs者，若无法获得下呼吸道标本，建议采集鼻咽拭子或外周血送检mNGS。
病毒性肺炎通常无明显咳痰，只有28%～33.7%的新型冠状病毒肺炎患者可以采集到痰标本。而鼻咽拭子在流感、新型冠状病毒肺炎中被证明具有很好的诊断价值。另有研究发现，血液标本在部分病毒的鉴定上优于BALF。外周血检测作为一项无创、简单及快速的检测方式，相对于BALF、肺组织活检等有创检查方法极具优势。所以如果无法获得下呼吸道标本，可以考虑采取上呼吸道标本或者外周血标本进行检测。
推荐10：对于肺部外周性病灶、局限性病灶或纵膈、纵膈/肺门淋巴结肿大，应根据病灶的特点，个体化选择有创性操作方式获取组织送检。
如果传统微生物检测方法阴性，经验性抗感染效果欠佳的局限性病灶、外周型结节团块病灶或纵膈/肺门淋巴结肿大，建议行有创性检查。需有经验的临床医师综合考虑，根据病灶大小、位置、与支气管位置、周围血管分布以及操作者对采样技术的熟练程度，分析操作的可行性和评估可能不良反应，选择更适合、活检成功把握度高的方法，如超声、CT或导航直视下操作可直达病变部位，精确取材可显著提高mNGS的检出阳性率。肺组织标本较BALF人源背景序列高，虽然目前无相关研究比较同一部位BALF和肺组织mNGS结果，既往的研究结果和经验显示，对于多种病原体，BALF较肺组织敏感度更高。以适当技术进行人源核酸去除可有效提高整体检测敏感度。同时建议新鲜组织行mNGS，虽然目前也有福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本行mNGS，但由于实验流程复杂，对DNA和RNA易造成损害。虽然FFPE可长期保存，但却很难被有效地处理和分析，另外易被如真菌、NTM及细菌等环境微生物污染。
推荐11：对于疑似肺部感染而无法取得呼吸道标本患者，建议采集外周血送检mNGS。
除了呼吸道感染继发血流感染的情况外，肺部病原凋亡后的细胞游离DNA依然可能释放到外周血中被检测到。当前对于外周血mNGS检测提示呼吸道感染责任病原的可行性缺乏大规模临床研究的支持，但是一些研究结果提示其可行性。在这类小规模研究中，对于呼吸道感染的患者，外周血中病原检测阳性率为35%～86.7%，造血干细胞移植患者疑似侵袭性曲霉感染患者中外周血mNGS检测的敏感度为51%，对于非曲霉侵袭性真菌感染的敏感度达79%。
推荐12：对于肺部病灶疑似为全身疾病累及的患者，建议采集其他局部病灶作为次选标本，送检mNGS。
某些病原体可导致全身多部位感染，如分枝杆菌、隐球菌、诺卡菌等，肺部病灶作为全身感染的一个部分，若临床上考虑一元论的可能性大，但又无法明确诊断时，可根据获得标本的难易程度及诊断价值，取多个病灶行mNGS检测，检测结果符合临床特征及胸部影像，可作为辅助诊断肺部病灶的依据。
3呼吸系统感染mNGS检测结果解读
mNGS具有无偏向性检出的特性，能检出临床标本中所有的微生物，而呼吸道感染有多种可能检测的标本，因其定植菌、微生物比例、空间异质性等存在差异，会对临床解读造成困惑。临床医师需密切结合患者的发病过程、实验室检查、影像学等结果，判断检出病原体是否符合临床诊断，并可进一步通过其他技术进行交叉验证。另外需指出，测序平台、流程、深度有所不同，该部分解读对大部分情况有参考价值，不除外特殊情况不符合者。
鼻咽拭子、痰、BALF属于呼吸道标本，能较好地反映上呼吸道或下呼吸道菌群状态，这类标本通常能检出多种微生物，其中多数可能为呼吸道常见定植菌。临床医师需在mNGS检出的众多微生物中筛选可能的致病菌，筛选过程参考的因素包括微生物自身特性（致病性、条件致病、定植及传染性等）、序列数（绝对序列数和占此标本中的相对比例）、特殊环境暴露史或病史、临床症状及检查等。序列数是指二代测序中检测到的短DNA序列的条数，序列数大小与标本中该微生物的数量正相关，但同时序列数也受到测序数据量、人源数据占比、物种基因组大小及基因组特异性序列比例等因素的影响。在不同的标本类型中，同样的序列数可能有截然不同的解读方式。呼吸道标本检出的微生物相对复杂，通常会检出序列数较多的定植菌，此时需要考虑其相对丰度，即该物种占这份标本中所有微生物的比例。
如何有效精准地解读呼吸道标本mNGS结果已成为临床医师关心的重点问题，呼吸系统标本mNGS检测结果解读需遵循以下原则：（1）检出结果需结合临床表现、实验室检查、及胸部影像学；（2）检出结果需结合其他传统微生物报告，并通过其他检测技术进行交叉验证；（3）结合检出微生物的种类、特异性序列数级相对丰度判断其为致病菌、定植菌还是背景菌；（4）若单一标本无法判定是否致病微生物，有条件情况下可结合多个不同类型标本的检测结果判断。表2详述了不同类型标本检出不同微生物的临床意义。
推荐13：若痰标本或BALF检出上呼吸道常见定植微生物，如草绿色链球菌、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属、念珠菌属等，考虑定植可能大。
健康人群鼻咽、口咽部存在定植微生物群，但其中一些微生物在健康宿主中也可在特定情况下致病，如由于既往病毒感染造成的损害、宿主免疫下降或呼吸道上皮屏障的物理破坏。根据标本来源、微生物的量以及白细胞数量来区分定植和感染是很关键的。对于mNGS报告解读，需熟悉定植病原体的种类。
推荐14：若痰标本或BALF检出不存在或很少存在于口腔的病原体，如嗜肺军团菌、衣原体、百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌等，考虑致病微生物可能大。
常见呼吸道确定的致病病原体如MTB、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、百日咳博德特氏菌、军团菌属、耶氏肺孢子菌、诺卡菌属、组织胞浆菌、球孢子菌属、隐球菌属、皮炎芽生菌及病毒等，此类病原体一旦检出即使序列数少仍需考虑致病微生物可能大。另有一些少见的呼吸道确定病原体如土拉弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、贝纳柯克斯体、鹦鹉衣原体、布鲁菌、沙门氏菌属、多杀巴斯德菌、水痘带状疱疹病毒、寄生虫。但仍需注意某些环境和水源性微生物，军团菌等致病菌也存在水源污染可能，判读需谨慎。
推荐15：若呼吸道标本检出结核分枝杆菌复合群（MTBC，包括MTB、卡内蒂分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛分枝杆菌），即使序列数极少，仍需考虑其为致病微生物的可能。
MTBDNA提取困难，而污染的可能性低，有研究主张在种或属水平上至少有1条特异性序列时被认为是阳性。当mNGS报告中检出序列数较低的MTB时，可要求检测机构对检出特异性序列进行复核，或对原始标本进行其他方法验证以确定检出的真实性。例如送检BALF标本，mNGS报告出1条MTB序列时，也应高度重视：一方面可要求报告出具方回溯检测流程和质控，对原始标本进行PCR验证；另一方面可加做XpertMTB/RIP等MTB特异性检测方式进行确认。MTBC中4种分枝杆菌的基因组序列具有很高的相似性，因此建议