目的
探讨对非小细胞肺癌新辅助治疗（新辅助化疗、新辅助靶向治疗及新辅助免疫联合化疗）后手术切除标本的病理评估。
方法
收集年1月至年3月同济大医院接受新辅助治疗后手术切除肺癌标本例。分析并比较90例［腺癌26例，鳞状细胞癌（简称鳞癌）64例］新辅助化疗患者（化疗组）、13例（腺癌13例）新辅助靶向治疗患者（靶向组）及10例（腺癌4例，鳞癌6例）新辅助免疫治疗联合化疗的患者（免疫联合化疗组）手术切除标本的肿瘤消退反应组织学特征（坏死、炎性细胞浸润、胆固醇裂隙、泡沫细胞聚集、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成）的差异及病理缓解［明显病理缓解（MPR）及完全病理缓解（PCR）］状况。
结果
化疗组非小细胞肺癌、靶向组肺腺癌及免疫联合化疗组非小细胞肺癌均可见残存肿瘤细胞发生退行性变，异型性增加，肿瘤床内见不同程度的坏死、泡沫细胞聚集、胆固醇裂隙、炎性细胞浸润、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成。化疗组、靶向组及免疫联合化疗组三者之间肿瘤消退反应组织学特征差异均无统计学意义（P0.05），但靶向组及免疫联合化疗组坏死所占的百分比最高10%及20%，而化疗组高达80%；1例免疫联合化疗组肺腺癌出现肿瘤消退床；免疫联合化疗组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内可有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润及淋巴滤泡的形成。化疗组肺腺癌及鳞癌MPR率分别为35%（9/26）及64%（41/64）；靶向组MPR比例为2/13；免疫联合化疗组肺腺癌及鳞癌MPR比例分别为2/4及2/6。化疗组肺腺癌及鳞癌PCR率分别为11%（3/26）及3%（2/64）；靶向组PCR比例0/13；免疫联合化疗组肺腺癌及鳞癌PCR比例分别为0/4及1/6。
结论
非小细胞肺癌不同的新辅助治疗方式引起组织病理学变化存在形式及程度上的差异，化疗组可见较多的坏死，免疫联合化疗组可出现消退床，免疫联合化疗组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内可有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润及淋巴滤泡的形成。
新辅助治疗是指在手术前所给予的综合治疗，目的是使肿瘤体积缩小、临床分期降低从而使原来不具备手术条件的恶性肿瘤患者获得手术机会，并可观察肿瘤对药物的敏感性，指导后续治疗。目前肺癌新辅助治疗包括新辅助化疗、新辅助靶向治疗、新辅助免疫治疗及各种联合治疗。对于新辅助治疗后肺癌手术标本的病理评估非常重要，可借此判断疗效，并预测患者预后。目前对于新辅助治疗病理缓解的程度缺乏精确的定义，包括明显病理缓解（MPR）和完全病理缓解（PCR）。一般认为，对于所有组织学类型的非小细胞肺癌，MPR的定义是残存肿瘤≤10%，PCR则为对包括所有区域淋巴结样本在内的切除的肺癌标本进行完整评估后，没有任何残存肿瘤细胞［1］。由于化疗、靶向治疗及免疫治疗作用机制不同，所以肿瘤消退反应组织学特征及病理缓解可能存在差异。我们试图研究3种不同治疗方式（新辅助化疗、新辅助靶向治疗及新辅助免疫治疗联合化疗）肿瘤消退反应组织学特征的差异及MPR、PCR状况。
01资料与方法
1.资料来源：收集年1月至年3月同济大医院接受新辅助治疗后手术切除肺癌标本例，所有病例术前均有活检或细胞学确诊，其中接受了新辅助化疗的患者（化疗组）90例［腺癌26例，鳞状细胞癌（简称鳞癌）64例］、新辅助靶向治疗的患者（靶向组）13例及新辅助免疫治疗联合化疗的患者（免疫联合化疗组）10例（腺癌4例，鳞癌6例）。接受新辅助治疗的患者中男性42例（79%），女性11例（21%），中位年龄为60岁（32~74岁）。化疗组26例肺腺癌患者中24例TNM分期Ⅲ期，2例TNM分期Ⅱ期，化疗组64例肺鳞癌患者中57例TNM分期Ⅲ期，5例TNM分期ⅡB期，1例TNM分期ⅡA期，1例TNM分期ⅠB期。化疗组26例肺腺癌患者使用培美曲塞联合顺铂或培美曲塞联合卡铂治疗方案（治疗2~4个周期），化疗组64例肺鳞癌患者接受使用吉西他滨联合顺铂或吉西他滨联合卡铂治疗方案（治疗2~4个周期）。靶向组的肺腺癌患者13例TNM分期均为Ⅲ期，7例具有表皮生长因子受体（EGFR）外显子21LR基因突变，5例具有EGFR外显子19缺失突变，1例具有间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因融合，靶向组中12例EGFR突变的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（治疗2~4个周期），靶向组中1例ALK融合的腺癌患者使用ALK酪氨酸激酶抑制剂。免疫联合化疗组4例肺腺癌及6例肺鳞癌患者TNM分期均为Ⅲ期，免疫联合化疗组4例肺腺癌患者使用的是PD-1抑制剂（信迪利单抗）联合化疗（培美曲塞联合顺铂或培美曲塞联合卡铂）的治疗方案（治疗2~4个周期），免疫联合化疗组6例肺鳞癌患者使用的是PD-1抑制剂（信迪利单抗）联合化疗（吉西他滨联合顺铂或吉西他滨联合卡铂）的治疗方案（治疗2~4个周期）。
2.大体检查和标本处理：回顾近期CT可辅助瘤床的大体定位，图1显示了化疗组患者右上肺6.5cm的肿块，通过触摸定位肿瘤床后，沿肿瘤床最大直径切开标本，测量肿瘤床的大小、肿瘤床与手术切缘的距离。如果难以识别或定位肿瘤，则回顾患者近期CT可辅助大体定位。≤3cm的肿瘤床应全部取材；对于3cm的较大肿瘤床，应将肿瘤床切成0.5cm厚的连续组织块，并且在粗略检查后，选取最具代表残存肿瘤的至少一个完整横切面（0.5cm厚）的组织块进行取样及拍照（图2），并将该组织块如图划分进行组织学映射（图3），肿瘤边缘组织学切片需包含1cm的相邻肺组织；对于3cm肿瘤床且肿瘤床的初始HE切片未发现残存肿瘤，应对肿瘤床全部取材；对于原发肿瘤位于肺门部的新辅助治疗肺鳞癌标本，一定要多取支气管黏膜。多数情况下，淋巴结较小可以完整地取材，但如果有非常大的淋巴结，可以通过淋巴结的中心切成两半，全部放在指定的包埋盒中［1］。所有标本经3.7%中性甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋切片及HE染色。
图1显示了新辅助化疗患者右上肺6.5cm的实性肿块
图2沿肿瘤床最大直径切开标本，应将肿瘤切成0.5cm厚的连续组织块，选取最具代表残存肿瘤的至少一个完整横切面的组织块进行取样及拍照
图3将最具代表残存肿瘤的一个完整横切面的组织块如图划分进行组织学映射
图4化疗组肺鳞癌细胞胞质丰富、核大、胞核出现空泡状变HE中倍放大
图5免疫联合化疗组肺腺癌细胞胞核大、深染、不规则、畸形怪状及多核HE中倍放大
图6靶向组肺腺癌细胞胞质丰富，且出现空泡样变，胞核大、深染、不规则、畸形怪状HE中倍放大
图7化疗组肺腺癌见大量坏死组织，其周围可见泡沫细胞、胆固醇裂隙及反应性多核巨细胞，另见小灶残存的腺癌组织HE低倍放大
图8靶向组见少量坏死组织，间质可见致密的胶原纤维组织形成，其内可见少量胆固醇裂隙、反应性肉芽肿及多个钙化灶形成HE低倍放大
图9免疫联合化疗组见少量坏死组织，其内可见少量胆固醇裂隙，周围见较多的泡沫细胞聚集HE低倍放大
图10免疫联合化疗组肺腺癌中出现了消退床，其内可见增殖性纤维化及新血管的生成HE中倍放大
图11免疫联合化疗组肺腺癌肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内有明显淋巴细胞、浆细胞浸润及淋巴滤泡的形成，肺泡腔内见较多的泡沫细胞HE低倍放大
图12化疗组肺鳞癌肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内见少量淋巴细胞浸润HE低倍放大
图13靶向组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内见少量淋巴细胞浸润HE低倍放大
3.组织病理学评估：由两位病理医师对例新辅助治疗患者手术切除肺癌标本的HE染色切片进行评估。肿瘤床指的是治疗前肿瘤所在的区域，肿瘤床成分包括：残存肿瘤、坏死组织、间质（包括炎性病变和纤维化），3种成分总和%，残存肿瘤%=残存肿瘤/（残存肿瘤+间质+坏死）×%［1］。全部病例肿瘤床HE染色切片3~38张。残存肿瘤、间质和坏死组织的百分比应根据每张HE染色切片进行评估，每个组成部分应以10%的增量进行评估，除非当记录单个百分比的估计值时，其百分比低于5%，将所有HE染色切片的结果取平均值，以确定每例患者的平均值。我们对间质进行评估，分析了组织学参数，包括炎性细胞浸润、胆固醇结晶沉积、泡沫细胞浸润、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成。这些参数被半定量分级为：不存在（-）、轻度存在（+）、中等存在（++）及广泛存在（+++）。根据年WHO肺、胸膜、胸腺和心脏肿瘤分类（第4版）标准对肿瘤进行分类。
4.统计学方法：采用SPSS21.0软件进行数据分析，计量资料采用中位数表示，多组间数据采用单因素方差分析；计数资料采用百分率表示，组间数据采用χ检验。以P0.05为差异有统计学意义。
02结果
1.大体检查：所有病例原发肿瘤均为单发，少量肿瘤床较小且质较软，大体检查时难以视诊或触诊，肿瘤床最大径达8cm。部分肿瘤床切面灰白色或灰白灰黑色，质中；部分肿瘤床切面可见灰黄色坏死物及空洞形成。
2.组织学特征：化疗组、靶向组及免疫联合化疗组部分残存肿瘤细胞胞质丰富及出现空泡样变，胞核大、深染、不规则、畸形怪状及多核（图4,5,6），还可见胞核空泡变。化疗组、靶向组及免疫联合化疗组可见不同程度的坏死，坏死组织周围可见含有脂质的泡沫巨噬细胞、胆固醇裂隙、炎性细胞浸润、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成（图7,8,9）。化疗组中14例见大量的梗死样坏死组织（图7）；靶向组4例及免疫联合化疗组6例见少量坏死组织（图8，9）。免疫联合化疗组个别腺癌中还出现了消退床，其内可见增殖性纤维化及新血管的生成（图10）。免疫联合化疗组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润及淋巴滤泡的形成，肺泡腔内见较多的泡沫细胞（图11）；化疗组及靶向组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内见少量淋巴细胞浸润（图12，13），可见机化性肺炎。
3.肺癌在3种不同的新辅助治疗方式中肿瘤消退反应组织学特征：化疗组、靶向组及免疫联合化疗组3者之间坏死、炎性细胞浸润、泡沫细胞聚集、胆固醇裂隙、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成差异无统计学意义（P0.05），靶向组及免疫联合化疗组坏死组织所占的百分比最高10%及20%，而化疗组高达80%。
4.肺癌在3种不同的新辅助治疗方式中病理缓解程度（表1）：化疗组MPR率为56%（50/90），其中化疗组肺腺癌及鳞癌MPR率分别为35%（9/26）及64%（41/64）；靶向组MPR比例为2/13；免疫联合化疗组MPR比例为4/10，其中免疫联合化疗组肺腺癌及鳞癌MPR比例分别为2/4及2/6。化疗组PCR率为6%（5/90），其中化疗组肺腺癌及鳞癌PCR率分别为11%（3/26）及3%（2/64）；靶向组PCR比例0/13；免疫联合化疗组PCR比例为1/10，其中免疫联合化疗组肺腺癌及肺鳞癌PCR比例分别为0/4及1/6。
03讨论
CT、PET-CT、MRI常用于评估非小细胞肺癌患者对新辅助治疗的反应，但结果差异较大，文献报道肿瘤病理缓解和CT应答的不一致率为41%~45%，肿瘤的炎性病变、纤维化成分可能会影响肿瘤大小的影像学判读，导致无法通过CT准确预测新辅助治疗的疗效［2,3］，因而组织学成为对新辅助治疗反应评估唯一较准确的方法。随着肺癌新辅助治疗在临床中的应用，对新辅助治疗肺癌手术切除标本进行病理评估愈发重要。我们首先应按肺癌新辅助治疗术后切除标本病理评估-国际肺癌研究协会多学科建议进行规范取材［1］，以优化对术后病理反应的评估。肿瘤床指的是治疗前肿瘤所在的区域，Travis等［1］建议把肿瘤床成分描述为：残存肿瘤、坏死组织和间质（包括炎性病变和纤维化）3种成分，3种成分总和%，并建议将其用于所有新辅助治疗（包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗及各种联合治疗）。
肿瘤床大体表现存在较大差异，对新辅助治疗反应较小的肿瘤，其肉眼外观与未治疗的肿瘤相似；对新辅助治疗有反应的肿瘤，部分切面可出现灰黄色坏死物及空洞形成，部分由于纤维化切面质韧，少数肿瘤治疗效果较好，切面瘤床较小或较软，大体检查时难以视诊或触诊。我们的研究中3种治疗方式均可见部分残存肿瘤细胞胞质嗜酸性及空泡变性，胞核大、深染、不规则、畸形怪状及多核，还可见胞核空泡变；文献报道新辅助化疗乳腺癌和肺癌中残存肿瘤细胞也出现类似退行性改变［2,3］。肿瘤床可见不同程度的坏死，坏死组织周围可见含有脂质的泡沫细胞聚集、胆固醇裂隙、反应性肉芽肿及间质胶原纤维形成，我们对这些肿瘤消退反应组织学特征进行了半定量分析，发现不同的新辅助治疗方式引起肿瘤消退反应组织学特征差异无统计学意义，但靶向组及免疫联合化疗组坏死组织所占的百分比最高只有10%及20%，而化疗组高达80%，表明新辅助化疗可出现较大范围的坏死，虽然三者的差异未达到统计学意义，但提示三者间可能存在一种联系或者一种趋势。可能与本组病例数相对较少有关，这些差异可能反映了药物作用的不同机制，化疗药物通过细胞毒性直接杀伤细胞，从而引起肿瘤细胞变性及坏死，新辅助免疫治疗通过激活肿瘤特异性T细胞间接杀灭肿瘤细胞，为肿瘤细胞提供营养的基质被破坏，从而导致整个肿瘤细胞巢的突然死亡，肿瘤细胞碎片被巨噬细胞迅速吞噬形成肉芽肿，因此，免疫联合化疗组坏死比例较低。与接受新辅助化疗后的肿瘤组织病理评估不同，Cottrell等［4］首次分析非小细胞肺癌患者新辅助免疫治疗的免疫相关病理反应，其重要特征是出现肿瘤消退床，消退床的特征：（1）免疫激活：如致密的淋巴细胞、浆细胞及淋巴滤泡形成。（2）细胞死亡：表现为出现坏死、泡沫细胞、胆固醇结晶及反应性肉芽肿。（3）组织修复：特别是增殖性纤维化（高成纤维细胞、胶原纤维比）和新血管形成。文献报道新辅助靶向治疗及新辅助免疫治疗与另一种药物联合治疗的患者的标本也表现出类似免疫相关病理反应特征［5］。本研究中化疗组和靶向组见免疫激活和细胞死亡现象，但未见增殖性纤维化（高成纤维细胞、胶原纤维比）和新血管形成，而免疫联合化疗组中肺腺癌出现了肿瘤消退床，且免疫联合化疗组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润及淋巴滤泡形成，肺泡腔内见较多的泡沫细胞，化疗组及靶向组肿瘤床旁的非肿瘤肺实质内见少量淋巴细胞浸润，我们推测可能与免疫治疗药物的作用机制有关，免疫介导的肿瘤消退方式是由外到内清除肿瘤细胞，肿瘤消退床位于残留肿瘤的周围，这种特征与文献报道相似［4］。我们的研究中有少数病例肿瘤消退反应组织学特征不明显甚至缺乏，所以在临床工作中要注意了解患者的治疗史，以免漏诊。
前期临床研究显示新辅助治疗后非小细胞肺癌残存肿瘤细胞占比≤10%与患者生存显著相关。因此，MPR是预测新辅助治疗疗效早期时间节点的重要指标。年美国病理学家协会及英国皇家病理医师学院也建议使用这个临界值［6,7］，该建议使得肺癌新辅助治疗的临床试验设计中可采用MPR作为治疗终点［8］。本组病例中新辅助化疗后，病理评估肺腺癌和鳞癌MPR率分别为35%（9/26）和64%（41/64）。与Liu-Jarin等［9］报道新辅助化疗肺腺癌和鳞癌MPR比例相似，5/18和8/12。而Qu等［10］研究则显示肺腺癌、鳞癌的MPR率仅为12%（23/）和26%（21/80），同时报道了肺腺癌和鳞癌不同的MPR值与患者预后显著相关。造成MPR率差异的原因，除了入组标本量、病例临床分期及治疗周期的不同外，另一种可能的原因是术后标本取材标准的差异。因此，国际肺癌协会病理委员会联合多学科专家，提出了肺癌新辅助治疗后标本取材规范的指导性意见［1］。该建议的制定对积累更多新辅助治疗切除术后符合取材规范的病例，进一步研究不同组织学类型肺癌最佳的MPR值，进行早期评估治疗疗效及预测患者长期生存具有至关重要的作用。临床试验新辅助靶向治疗非小细胞癌残存肿瘤百分比的中位数为45%（1%~85%），其MPR率为9.7%（3/31），PCR率为0（0/31）［11］。与我们研究中靶向组病例相似，残存肿瘤百分比的中位数为70%（0~90%），MPR及PCR比例分别为2/13和0/13。Shu等［12］研究中新辅助免疫治疗联用化疗肺腺癌及鳞癌的MPR比例分别为8/15和8/10；PCR比例分别为5/15和5/10；我们的研究中免疫联合化疗组肺腺癌及鳞癌MPR比例分别为2/4及2/6，其PCR比例分别为0/4及1/6，文献报道的结果和我们的结果略有差异，尚不明确这种差异是否由样本量、肿瘤异质性等因素造成。文献报道，免疫新辅助治疗和手术之间的特定时间间隔对于增强全身抗肿瘤作用至关重要。免疫疗法启动后过早或等待时间过长进行手术会削弱新辅助治疗的作用［13］。因此寻找发挥免疫新辅助治疗作用最佳的标志物指导手术时间，有待于更多的临床试验进一步研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
TravisWD,DacicS,WistubaI,etal.IASLCmultidisciplinaryre