实验性急性非洲猪瘟肝组织损伤及相关机制的研究李樵锋1李慧2梁浩钊1徐志高1张伟伦1罗颖1许正涛1杨鸿1黄璐琦2邓桦11.佛山科学技术学院生命科学与工程学院2.中国中医科学院摘要：为探讨非洲猪瘟病毒（ASFV）对肝的组织损伤及其病理机制，本试验人工接种ASFV(Pig/HLJ/18毒株，剂量为HAD50/mL)，复制急性非洲猪瘟病例，观察13头死亡猪肝脏的剖检变化和组织学变化，采用原位PCR方法，对肝内ASFV病毒VP73蛋白进行定位，以免疫组织化学方法对肝组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和凋亡因子Bax、Bcl-2的表达进行检测。结果表明，ASFV可对肝的组织结构造成明显损伤，随病程的延长病变逐渐加重，剖检见肝脏淤血、出血，灰白色花斑状炎症灶，胆囊水肿，充血出血。组织学病变以出血和病毒性肝炎为主，肝细胞水肿、坏死和凋亡，淋巴细胞浸润；ASFV主要分布于肝窦、肝小叶汇管区、小叶间质的巨噬细胞；TNF-α、IL-1β、IFN-γ主要在巨噬细胞、肝细胞、血管内皮细胞和少量淋巴细胞中呈阳性表达，其表达强度随损伤程度加重而显著升高（P＜0.01）；Bax表达升高（P＜0.01）的同时Bcl-2表达下降（P＜0.01），诱导了细胞凋亡发生。本研究结果提示ASFV通过对肝内单核-巨噬细胞系统的破坏，诱导炎症因子大量释放并激活炎症级联反应，从而造成严重的肝组织损伤。作者简介：李樵锋，男，硕士研究生，基础兽医学专业;邓桦，E-mail
enghuafosu.edu.cn;基金：中央本级重大增减支项目();非洲猪瘟（Africanswinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）感染各年龄段家猪和野猪，并引起以高热、各器官广泛性出血和免疫抑制为主要特征的急性、热性、高度接触性传染病，其高毒力分离株可引起超急性和急性感染，且在感染后4~15天内发病，病死率高达%[1]。我国是世界第一大养猪国，养猪产业在我国占有重要的地位，猪肉消费长期占据国内肉类消费比重的60%以上，然而自年国内首次发现非洲猪瘟后，疫情迅速传播，使我国的生猪产业链遭受巨大打击[2,3]，与此同时，随着认识的深入与早期措施的介入，非洲猪瘟也出现了一些新的临床症状与病理变化，为临床鉴别诊断带来困难。ASFV主要在猪的单核-巨噬细胞系统（mononuclearphagocytesystem，MPS）中复制，并可感染内皮细胞、巨核细胞和中性粒细胞[4,5]，肝脏中有单核巨噬细胞和自然杀伤细胞群，窦状隙的肝巨噬细胞是从肠道吸收传染源、内毒素和异物进入全身循环前的第一道防线[6]。它也是ASFV二次复制的部位[7]，在ASFV感染过程中起着重要的作用。肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactoralpha，TNF-α）主要由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生，在病毒感染肝脏时，会使免疫系统活化，产生并释放各种细胞因子，诱导肝细胞合成大量的TNF-α[8]；白介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）是TNF-α激活免疫细胞后释放的促炎因子，在促进炎症反应、介导肝细胞损伤的过程中起重要作用；干扰素-γ（interferon-gama，IFN-γ）由活化的T淋巴细胞产生，可反应淋巴细胞的活跃程度；B细胞淋巴瘤因子2型（bcelllymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（bcl2-associatedX，Bax）同为Bcl-2家族成员，前者为细胞凋亡过程中的一类重要的抑制基因，其高度表达可阻断细胞凋亡的发生，后者则能激活细胞色素C释放进入胞质，使Bcl-2与APaf-1分离并激活caspase，从而诱导细胞凋亡[9]，Bax表达增加可拮抗Bcl-2的作用，促进细胞凋亡，反之则抑制凋亡。ASFV虽然早已被发现多年，但由于其基因型的多样性和复杂的逃逸机制，迄今为止仍然没有安全有效的商品化疫苗问世，故此还需要探索更多有关ASFV病理学的相关研究，进而从ASFV的致病机制中找到病毒的弱点和对抗病毒的作用机理。本课题组前期已对急性非洲猪瘟的系统病理学研究进行了报道[10]，本研究拟在实验条件下，进一步研究急性非洲猪瘟病毒Ⅱ型Pig/HLJ/18毒株引起的肝脏剖检变化和组织学变化，通过对病毒VP73蛋白进行定位，检测炎症因子TNF-α，IL-1β，IFN-γ及凋亡因子Bcl-2和Bax的表达，探讨ASFV对肝脏的损伤及其致病机制，为临床病理诊断与防控提供参考，同时对疫苗和治疗药物的研发提供理论依据。1材料与方法1.1毒株及试剂非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/18毒株，由哈尔滨兽医研究所惠赠；原位PCR试剂盒，购自外显子公司；1MTris-HCl缓冲液，蛋白酶K和DAPI抗荧光衰减封片剂，购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人TNF-α单克隆抗体（批号：AF），兔抗人IL-1β单克隆抗体（批号：AF）和兔抗人IFN-γ单克隆抗体（批号：AF），兔抗人Bax单克隆抗体（批号：AF）和兔抗人Bcl-2抗体（批号：AF），购自AffinityBiosciences公司；免疫组化试剂盒，购自北京中杉金桥生物工程有限公司。1.2动物试验试验全程在中国动物疫病预防控制中心动物生物安全三级实验室进行。将60日龄，体重约20Kg的健康长白猪18头，观察适应6d后随机分为两组：13头为感染组，肌肉注射Pig/HLJ/18毒株，剂量为HAD50/mL，5头为对照组，注射等量生理盐水。1.3剖检观察和病料采集死亡猪立即进行剖检，对照组试验结束后处死剖检。采集肝脏相同部位和病变明显部位，大小为1.5cm×1.5cm×2cm，放入40g/L的多聚甲醛中固定。1.4非洲猪瘟感染猪肝病理组织学变化的观察对固定后的肝组织进行修整，自来水冲洗，后进行梯度脱水、浸蜡、包埋，制备连续切片（厚度为5μm），苏木素-伊红染色，显微镜观察。1.5非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白在肝组织中的定位采用原位PCR法对肝组织中非洲猪瘟病毒VP73蛋白进行定位，根据非洲猪瘟VP73蛋白序列（GenBank登录号：S），利用PrimerPremier5.0软件设计1对特异性引物，P1/F：5￠-ATGGCATCAGGAGGAGC-3￠，P1/R：5￠-CTGGGGAATACCAAAGGT-3￠，该引物理论跨度为bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将固定48h的组织进行冲洗、梯度脱水、浸蜡、包埋，制备连续切片；将切片60℃烤片5min，二甲苯脱蜡10min×2，后梯度酒精脱去二甲苯，0.1mol/LTris-HCl缓冲液冲洗5min；取出切片，甩去多于液体，滴加蛋白酶K，覆盖组织，37℃消化20min，95℃孵育2min，0.1mol/LTris-HCl缓冲液冲洗5min×2；标本上加μL变性缓冲液，加盖玻片覆盖，放于95℃的杂交仪上，孵育5min取出后立即放在冰上，揭去盖玻片，甩去多于液体；每张片加InSituMix20μL，PrimerMix3μL，TaqEnzyme1μL，H2O6μL，共30μL，加盖玻片，橡皮胶将盖玻片四周封片，放入原位PCR仪中，反应条件：95℃变性60s；55℃退火90s，74℃延伸90s，74℃再延伸3min，20个循环；30℃10s终止反应；揭去盖玻片，浸入0.1mol/LTris-HCL缓冲液5min×2，浸入预冷的%乙醇中固定10min，浸入0.1mol/LTris-HCl缓冲液中5min；将Anti-Digoxin-Cy3与1%BSA按1:比例稀释，滴加于标本上，覆盖组织，37℃孵育1h后，PBS洗涤5min×3，滴加20μLDAPI抗荧光衰减封片剂，盖玻片封片，荧光显微镜下观察拍照。1.6非洲猪瘟感染猪肝组织TNF-α，IL-1β，IFN-γ，Bax和Bcl-2的检测通过免疫组织化学染色法对炎症因子TNF-α，IL-1β，IFN-γ和凋亡因子Bax和Bcl-2进行检测，石蜡切片常规脱蜡，孵育，3％过氧化物酶阻断，加TNF-α抗体（浓度为1:），加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育，DAB显色，苏木素复染，冲洗，脱水，中性树胶封片，镜下观察。IL-1β，IFN-γ，Bax和Bcl-2分别按照以上步骤操作，抗体浓度分别为1:，1:，1:和1:。阳性对照选择1例已知病毒性肝炎肝组织，阴性对照使用PBS代替一抗进行检测。每张切片选取6个视野，运用ImageJ1.0图像分析软件测定TNF-α，IL-1β，IFN-γ，Bax和Bcl-2的阳性表达率。1.7数据处理采用SPSS26.0软件对数据进行统计分析，使用单因素方差分析和多重比较法进行差异显著性检验。试验结果以“平均值±标准差”方式表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。2结果2.1非洲猪瘟感染猪死亡情况和肝剖检变化感染组自攻毒后第6d开始出现死亡，至15d全部死亡，发病率为％，死亡率为％，感染组死亡猪各组织器官均出现不同程度的病变，可见出血性淋巴结炎，急性炎性脾肿、肺水肿等。剖检可见肝的损伤明显，且呈现渐进的发展过程，通过对肝组织病变程度的分析，将之分为轻度，中度和重度三个病变等级。轻度病变见肝轻度淤血呈深红色，胆囊壁水肿增厚，血管扩张（图1a~1c）；中度病变见肝为暗红色，胆囊壁呈树枝状充血，胆汁浓稠，呈棕黄色，肝脏出现少量点状或豆状大小的灰白炎症灶（图1d~1f）。重度病变见肝脏呈黑红色，胆囊发黑，肝脏间质增宽，实质中见大量边缘不整的灰白炎症灶（图1g~1i）。图1非洲猪瘟感染猪肝剖检变化Fig.1Africanswinefeveranatomopathologicalchangeinliverofpigs轻度病变:1a~1c;中度病变:1d~1f;重度病变:1g~1iMild:1a~1c;Moderat:1d~1f;Severe:1g~1i2.2非洲猪瘟病毒VP73蛋白在肝组织中的分布通过原位PCR方法对肝组织中非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白进行定位（图2），可见产生的红色荧光在肝的汇管区、肝小叶间质和肝窦中分布较多（图2a，2b），大量巨噬细胞被感染，除此之外，在肝细胞和血管内皮细胞上也有荧光表达（图2c，2d）。图2非洲猪瘟病毒VP73蛋白在肝组织内的分布Fig.2DistributionofAfricanswinefevervirusproteinVP73inliver蓝色
API,胞核;红色:Cy3,非洲猪瘟病毒VP73蛋白Blue
API,nucleus;Red:Cy3,VP73proteinofAfricanswinefevervirus2.3非洲猪瘟感染猪肝组织学变化通过苏木素-伊红染色法对肝组织切片染色后进行观察，可见非洲猪瘟病毒对肝组织造成明显损伤，根据病变程度的不同仍可分为轻度，中度和重度三个病变等级。轻度病变见肝中央静脉中有少量淤血，汇管区可见大量巨噬细胞、淋巴细胞和少量浆细胞汇集，门静脉中见纤维蛋白液渗出，窦状隙变窄，其间有红细胞、淋巴细胞和巨噬细胞，肝细胞轻微水肿（图3a~3c）；中度病变见大量红细胞淤积，导致中央静脉消失，汇管区以大量淋巴细胞浸润为主，肝小叶间质增宽，肝索受红细胞挤压断裂，肝细胞破裂，胞核裸露，并见大量含铁血黄素和纤维蛋白（图3d~3f）；重度病变因淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和红细胞浸润而导致肝小叶间质显著增宽，肝小叶萎缩并被分隔成岛屿状，形成大量假小叶。肝索萎缩断裂，窦状隙内多见淋巴细胞坏死和凋亡，肝细胞排列紊乱，大量细胞胞核固缩深染，崩解（图3g~3i）。图3非洲猪瘟感染猪肝组织学变化（苏木素-伊红染色）Fig.3HistopathologicalchangesofliverinfectedwithAfricanSwineFever(H＆Estain)轻度病变:3a~3c;中度病变:3d~3f;重度病变:3g~3iMild:3a~3c;Moderat:3d~3f;Severe:3g~3i2.4非洲猪瘟感染猪肝组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ和Bax、Bcl-2表达的变化感染组肝组织TNF-α、IL-1β、IFN-γ主要在单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、血管内皮细胞和少量淋巴细胞呈黄色或棕褐色表达，对照组TNF-α、IL-1β、IFN-γ的仅见少量细胞浅黄色着色（图4a~4l）；Bax随着病变程度加重而着色加深呈强阳性，Bcl-2则逐渐变浅呈弱阳性表达（图4m~4t）。通过ImageJ软件对免疫组化切片进行统计分析（图5），感染组肝组织TNF-α、IL-1β的阳性表达率均极显著高于对照组（P＜0.01），中度病变与重度病变肝组织IFN-γ表达率与对照组相比也有显著差异（P＜0.01）；此外，与对照组相比，中度与重度病变肝组织Bax表达率极显著升高（P＜0.01），而Bcl-2表达率极显著降低（P＜0.01）。图4非洲猪瘟感染猪肝组织中TNF-α,IL-1β,IFN-γ和Bax,Bcl-2的表达变化Fig.4ExpressionofTNF-α,IL-1β,IFN-γ,BaxandBcl-2inliverofpigsinfectedwithAfricanswinefeverTNF-α:4a~4d,IL-1β:4e~4h,IFN-γ:4i~4l,Bax:4m~4p,Bcl-2:4q~4t图5感染猪肝组织中TNF-α，IL-1β，IFN-γ和Bax，Bcl-2的阳性表达率Fig.5PositiveexpressionratesofTNF-α,IL-1β,IFN-γandBaxandBcl-2inliverofinfectedpigs注：与对照组比较,柱标**表示差异极显著(P＜0.01),无字母或相同字母表示差异不显著Note:
